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核酸電泳的步驟方法介紹

發(fā)布日期: 2017-02-28
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核酸電泳是進(jìn)行核算研究的重要手段,常用于和瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠兩種,凝膠電泳操作簡(jiǎn)單,是分離鑒定和純化核算的一種常用方法,那么核酸電泳的步驟有哪些的呢?

瓊脂糖凝膠電泳的步驟:

用透明膠將玻璃板或電泳裝置所配備的塑料盤的邊緣圈封,制成膠模,置水平工作臺(tái)上;

(2) 稱取適量瓊脂糖,置電泳緩沖液中,加熱使瓊脂糖溶解;

(3) 待溶液冷60℃,加入10mg/ml EB貯存液,使終濃度達(dá)0.5mg/ml;

(4) 在距離膠模底板0.5-1mm處放置電泳梳,將瓊脂糖溶液倒入膠模中,厚度約3-5mm,注意避免產(chǎn)生氣泡;

(5) 凝膠*凝固后,移去梳子和透明膠,將凝膠放入電泳槽。加入TBE緩沖液使恰好沒(méi)過(guò)膠面約1mm;

(6) 將DNA樣品與1/6體積加樣緩沖液混合后,加入樣品槽中;

(7) 接通電源,使樣品槽在負(fù),用1-5v/cm的電壓,電泳適當(dāng)時(shí)間;

(8) 電泳結(jié)束后,可將含EB的凝膠直接放在紫外線檢測(cè)儀上觀察,并拍照記錄,也可將不含EB的凝膠在0.5μg/ml的EB溶液中染色30-45分鐘,再如上觀察和拍照,記錄結(jié)果。

聚丙烯酰胺凝膠電泳的步驟:

(1) 配制試劑

① 30%丙烯酰胺:100ml雙蒸水中含29g丙烯酰胺和1g N,N’-亞甲雙丙烯酰胺。

② 5×TBE 每升溶液含54g Tris.HCl,27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。

③ 10%過(guò)硫酸銨:10ml雙蒸水中含1g過(guò)硫酸銨。

(2) 裝置膠?!⒉AО搴蛪|條事先用去污劑刷洗,并經(jīng)自來(lái)水和無(wú)離子水沖洗干凈,晾干。裝置時(shí),將較大的玻璃板平放在工作臺(tái)上,將兩個(gè)墊條放在玻璃板兩側(cè),涂上少量凡士林,并將上層玻璃板置于墊條上,用夾子將玻板連同墊條夾緊,底部用1%瓊脂糖密封。為防止漏膠,除放梳子一邊外,其余三邊應(yīng)用防水膠帶密封。

(3) 根據(jù)玻璃板大小及夾層厚薄計(jì)算所需凝膠溶液量,按表配制溶液(100ml)。

 

濃度

3.5

5.0

8.0

12.0

20.0

30%丙烯酰胺(ml)

11.6

16.6

26.6

40.6

66.6

水(ml)

67.7

62.7

52.7

39.3

12.7

5×TBE(ml)

20.0

20.0

20.0

20.0

20.0

10%過(guò)硫酸銨(ml)

0.7

0.7

0.7

0.7

0.7

 

將35μl TEMED加入100ml混合液中,混勻,然后均勻連續(xù)注入兩玻璃板空隙中。

(4) 立即插入電泳梳,勿使梳齒下形成氣泡。

(5) 室溫聚合1小時(shí),梳齒下出現(xiàn)折光帶時(shí),表明聚合反應(yīng)已經(jīng)完成。若凝膠不立即使用,可用紗布或?yàn)V紙(用1×TBE浸泡)包蓋于凝膠頂部,置4℃保存1-2天。

(6) 拔去梳子,立即用水沖洗加樣孔。

(7) 除去底部膠帶,將凝膠直立放入電泳槽。在上下兩槽中灌好1×TBE溶液,驅(qū)盡凝膠底部附著的氣泡。并用1×TBE溶液沖洗加樣孔;

(8) 將核酸樣品與適量6×凝膠加樣緩沖液(見(jiàn)表2-28)混合,并加入凝膠加樣孔中;

(9) 接通電源,正極與下槽連接。電壓一般控制在1.8v/cm。電壓過(guò)高時(shí)凝膠產(chǎn)生的熱量可造成DNA區(qū)帶彎曲,甚引起小DNA片段的解鏈;

(10) 電泳畢,取下玻板和凝膠,放在工作臺(tái)上,從夾層一角輕撬,將上面的玻板輕輕移開,并小心揭下凝膠,置染色液中染色并進(jìn)行結(jié)果觀察。

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