PCR定量試劑盒前期的驗證引物探針性能和確定適反應(yīng)條件是確保正式實驗順利進(jìn)行的前提。那么前期驗證引物探針我們需要怎么確定呢？主要指標(biāo)是基線、擴增曲線、Ct值、擴增效率、低濃度樣本檢出、CV等。
一、基線
基線是PCR擴增曲線中水平的線，在PCR擴增反應(yīng)的循環(huán)中，熒光信號變化不大，成一條直線，這條直線即基線。
在PCR定量試劑盒引物探針篩選時，要注意基線是否水平。引物探針濃度純度都會影響基線，如導(dǎo)致基線上抬，下降等。而基線也是一個很直觀的指標(biāo)。
二、擴增曲線
另一個直觀地指標(biāo)是擴增曲線形態(tài)，呈S形曲線，避免有二次擴增，或者其他不正常的擴增曲線。
三、Ct值
從基線到指數(shù)增長的拐點對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)為Ct值。
對于同一個樣本，不同的引物探針結(jié)果為不同的擴增曲線，對應(yīng)的Ct值受擴增效率，干擾程度等影響會不一樣，理論上我們選擇的引物探針Ct值越小越好。
評估PCR擴增效率可靠和穩(wěn)定的一種方法是標(biāo)準(zhǔn)曲線，也是被研究者們廣泛認(rèn)可的。該方法涉及到制作一系列的樣品來控制目標(biāo)模板的相對數(shù)量。PCR定量試劑盒通常由濃縮的原液連續(xù)稀釋而成，常用的是10倍稀釋。
使用一系列稀釋樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)qPCR程序進(jìn)行擴增獲得Cq值，然后根據(jù)各樣品濃度及相應(yīng)的Cq值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Cq=-klgX0+b，擴增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR進(jìn)行定量分析時，要求擴增效率范圍在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。
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