木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC1615

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

產(chǎn)品說明：

木質(zhì)素過氧化物酶（EC1.11.1.14）（Lip）是一種含亞鐵血紅素的過氧化物酶，是木質(zhì)素的生物降解過程中的主要木質(zhì)素降解酶類。Lip在飼料資源開發(fā)以及廢水、廢物處理領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

藜蘆醇可以被Lip催化發(fā)生氧化反應(yīng)，其產(chǎn)物藜蘆醛在310nm處有最大吸收峰，以藜蘆醇為反應(yīng)底物，通過測定310nm處藜蘆醛的吸光值，可以判定Lip的酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、超聲波細(xì)胞破碎儀、研缽/勻漿器、微量石英比色皿/96孔（UV板）、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照樣本質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1:5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿；10000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2、細(xì)菌或細(xì)胞樣本：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為 500~1000:1 的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一）加入試劑一，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率300W，超聲 3s，間隔 7s，總時間3min），10000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測。

3、培養(yǎng)液或其他液體：直接檢測。若溶液渾濁則離心后取上清進(jìn)行測定。

二、測定步驟

1、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至310nm，蒸餾水調(diào)零。

2、測定前根據(jù)實驗用量取出部分試劑一、試劑二、試劑三置于37℃預(yù)熱10min以上。若一次性測定樣本過多，可根據(jù)使用量將試劑一、二、三按6:2:1比例配成工作液后進(jìn)行預(yù)熱，測定時按照20μL樣本+180μL工作液加入微量石英比色皿/96孔（UV板）進(jìn)行測定。

3、加樣表（在微量石英比色皿/96孔（UV板）中依次加入下列試劑)：

     將上述試劑分別加入微量石英比色皿/96孔（UV板）后迅速吹打混勻，從加完最后一個試劑開始計時，記錄第15s的吸光值A1，將混合液置于37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5min（培養(yǎng)箱有控溫功能的可以將溫度調(diào)至37℃），取出測定5min15s時的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1，注意保證測定時間的準(zhǔn)確性。

三、Lip活力的計算

A．用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

1.按樣本蛋白質(zhì)濃度計算

酶活定義：37℃，pH4.5條件下，每mg組織蛋白每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活單位。

Lip活性（U/mg prot）= ΔA×V反總÷(?×d)×109÷(V樣×Cpr)÷T=215.05×ΔA÷Cpr

2.按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：37℃，pH4.5條件下，每g組織每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活單位。

Lip活性（U/g 質(zhì)量）= ΔA×V反總÷(?×d)×109÷(V樣÷V樣總×W)÷T=215.05×ΔA÷W

3.按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：37℃，pH4.5條件下，每104細(xì)菌/細(xì)胞每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活單位。

Lip活性（U/104 cell）= ΔA×V反總÷(?×d)×109÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)÷T=215.05×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4. 按照樣本體積計算

酶活定義：37℃，pH4.5條件下，每mL血清或液體樣本每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需酶量為一個酶活單位。

Lip活性（U/mL）=ΔA×V反總÷(?×d)×109÷V樣÷T=215.05×ΔA

ε：藜蘆醛摩爾消光系數(shù)：9300L/mol/cm；d:比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，2×10^-4L；V樣：加入樣本體積，0.02mL，V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，5 min；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

B．用96孔UV板測定的計算公式如下：

1. 按樣本蛋白質(zhì)濃度計算

酶活定義：37℃，pH4.5條件下，每mg組織蛋白每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活單位。

Lip活性（U/mg prot）= ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷(V樣×Cpr)÷T=358.42×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：37℃，pH4.5條件下，每g組織每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活單位。

Lip活性（U/g 質(zhì)量）= ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T=358.42×ΔA÷W

3. 按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：37℃，pH4.5條件下，每10⁴細(xì)菌/細(xì)胞每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活單位。

Lip活性（U/10⁴ cell）= ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)÷T=358.42×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4. 按照樣本體積計算

酶活定義：37℃，pH4.5條件下，每mL血清或液體樣本每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需酶量為一個酶活單位。

Lip活性（U/mL）=ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷V樣÷T=358.42×ΔA

ε：藜蘆醛摩爾消光系數(shù)：9300L/mol/cm；d:比色皿光徑，0.6cm；V反總：反應(yīng)總體積，2×10^-4L；V樣：加入樣本體積，0.02mL，V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，5 min；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

實驗實例：

取0.1125g杏鮑菇加入1mL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清置冰上，之后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算A1=0.2294，A2=0.5322，ΔA=A2-A1=0.3028，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

Lip 活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷V樣÷T=142.09 U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Konadu K T, Harrison S, Osseo-Asare K, et al. Transformation of the carbonaceous matter in double refractory gold ore by crude lignin peroxidase released from the white-rot fungus[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2019, 143(1996):104735.

[2] Ahmed A A Q, Mckay T J M. Potential of Bacillus sp. LG7 as a Promising Source of Ligninolytic Enzymes for Industrial and Biotechnological Applications[J]. Proceedings of the National Academy of ences India, 2017.

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